BACKGROUND: Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) is a promising diagnostic tool for infectious diseases with high potential for transitioning to a point-of-care test format. It is used to detect a wide range of infectious pathogens, but there are virtually no similar tests for enteric pathogens in Russia.
AIM: The aim of the study was to evaluate a diagnostic reagent kit for the detection of DNA of enteric pathogens such as Shigella spp., enteroinvasive E. coli (EIEC), Salmonella spp., thermophilic Campylobacter, and group F enteric adenoviruses using LAMP.
MATERIALS AND METHODS: Fragments of ipaH Shigella, invA Salmonella, CJE0832 Campylobacter jejuni and Campylobacter coli genes and the adenovirus F 40 hexon gene were used as targets for amplification. A total of 254 clinical specimens were collected from patients with typical symptoms of diarrhea and asymptomatic patients. A 10% suspension in phosphate-buffered saline was prepared and solid particles were precipitated to obtain the fecal extract. DNA was isolated from the extracts using AmpliTest®Ribo-Prep (MA No. РЗН 2020-12985 (RZN 2020-12985), 22 December 2020) and AmpliTest® Magno-Sorb-Combo (MA No. РЗН 2022_19200 (RZN 2022_19200), 21 December 2022) reagent kits manufactured by the Centre for Strategic Planning of the Federal Medical and Biological Agency of Russia. The amplification results were detected using specific fluorescent probes. Amplification was performed in a multiplex format using two mixtures, the first for the detection of Shigella , EIEC, Campylobacter, and internal control sample DNA, and the second for the detection of Group F Adenovirus and Salmonella DNA.
RESULTS: Analytical sensitivity was evaluated using model biomaterial samples containing target DNA at known concentrations. Shigella, EIEC, Salmonella, Campylobacter and Group F Adenovirus DNA was reproducibly detected at a level of at least 5×103 copies/mL (total number of repeats n =60). Specificity was confirmed on a panel of DNA from different strains of adenoviruses and bacteria. A study of 254 clinical samples showed concordance between results obtained using the proposed LAMP protocol and a PCR (polymerase chain reaction) technique (a reference AmpliSens® OKI-screen-FL kit). The diagnostic sensitivity of the LAMP protocol was at least 92.6% and the specificity was at least 98.2% at the 95% confidence level (p =0.95). The high analytical and diagnostic characteristics of the proposed AmpliTest® OKI LAMP reagent kit were confirmed by clinical laboratory tests. The kit was registered as a medical device for in vitro diagnostics (MA No. РЗН 2024/23503 (RZN 2024/23503) dated September 4, 2024).
CONCLUSION: The proposed LAMP reagent kit is designed to detect enteric pathogens in less than one hour with analytical and diagnostic characteristics comparable to PCR.
Обоснование. Изотермическая петлевая амплификация LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) — перспективный для диагностики инфекционных заболеваний метод, имеющий высокий потенциал перехода к формату тестов «у постели больного». Он применяется для обнаружения широкого спектра возбудителей инфекционных заболеваний, однако подобные тесты для выявления возбудителей кишечных инфекций в Российской Федерации практически отсутствуют.
Цель — испытания диагностического набора реагентов для выявления ДНК возбудителей кишечных инфекций Shigella spp., энтероинвазивных E. coli, Salmonella spp., термофильных Campylobacter и кишечных аденовирусов группы F методом LAMP.
Материалы и методы. Использовали в качестве мишеней для амплификации фрагменты генов ipaH Shigella, invA Salmonella, CJE0832 кампилобактерий C. jejuni и C. coli, гена белка гексона аденовируса F 40. Клинические образцы получали от пациентов с характерными симптомами диареи и от пациентов без симптомов, всего 254 образца. Для приготовления экстракта кала готовили 10% суспензию в фосфатно-солевом буфере, осаждали твёрдые частицы. Для выделения ДНК из экстрактов использовали наборы реагентов «АмплиТест® Рибо-Преп» (РУ № РЗН 2020-12985, 22.12.2020) и «АмплиТест® Магно-Сорб-Комбо» (РУ № РЗН 2022_19200, 21.12.2022) производства ФГБУ «ЦСП» ФМБА России. Результаты амплификации детектировали с использованием специфических флуоресцирующих зондов, амплификацию проводили в мультиплексном формате с использованием двух смесей, первая из которых позволяет выявлять ДНК Shigella и EIEC, Campylobacter и ВКО, а вторая — ДНК аденовирусов группы F и Salmonella.
Результаты. Аналитическую чувствительность оценивали на модельных образцах биоматериала, содержащих ДНК целевых мишеней с известной концентрацией. Показано, что ДНК Shigella, EIEC, Salmonella, Campylobacter и аденовирусов группы F воспроизводимо выявляется в концентрации не менее 5×103 копий/мл (общее количество повторов n =60). Cпецифичность подтверждена на панели ДНК штаммов аденовирусов различных типов и ДНК бактериальных штаммов. При исследовании 254 клинических образцов показано совпадение результатов, полученных разработанным протоколом на основе LAMP и методом ПЦР (набор сравнения «АмплиСенс® ОКИ-скрин-FL»). Диагностическая чувствительность LAMP протокола составила не менее 92,6%, специфичность — не менее 98,2% с учётом доверительной вероятности ( p =0,95). Высокие аналитические и диагностические характеристики разработанного набора реагентов «АмплиТест® OKI LAMP» были подтверждены при проведении клинико-лабораторных испытаний, набор зарегистрирован в качестве медицинского изделия для диагностики in vitro (РУ РЗН 2024/23503 от 04.09.2024).
Заключение. Разработанный набор реагентов на основе LAMP позволяет выявлять кишечные патогены за время, не превышающее один час, и имеет аналитические и диагностические характеристики, сравнимые с ПЦР.