Background: In recent decades, considerable attention has been paid to the study of the gut microbiota. Nevertheless, the existing diagnostic approaches to assessing the gut microbiota in clinical practice are very limited. In this regard, there is a need to introduce a validated laboratory method, taking into account modern ideas about the gut microbiota.
Aim: to compare the results of gut microbiota examination by a routine culture method and real-time PCR in children
Methods: 102 stool samples from children aged 0 to 14 years were simultaneously examined by a routine culture method and real-time PCR. The PCR was performed using the "Enteroflor Kiddy Kit" (DNA-Technology, Russia), which allows to determine the quantity of total bacterial mass, 40 groups of normal and opportunistic microorganisms, estimated numbers of "child" and "adult" bifidobacteria, the Clostridioides difficile enterotoxin genes – cdtA and cdtB, the Streptococcus agalactiae adhesin gene – Srr2, the staphylococcal marker of resistance to beta-lactam antibiotics – gene mecA, as well as the relative abundance of each bacterial group.
Results: The culture method allowed to isolate up to 15 microbial groups in the samples. The real-time PCR identified 43 groups, 2 virulence genes and one gene for antibiotic resistance in amounts up to 1011 GE/g, allowed to calculate the abundance of each target bacterial group from all detected bacteria. The best result matching between the culture method and the real-time PCR was noted for C. albicans (100% of double-negative results), Bifidobacterium spp. (92.2% matches), E. coli (80.4% matches) and S. aureus (64.7% matches). Whereas for the other compared microbial groups, the matching results were recorded only in 9.8-36.3% of the samples. The greatest discrepancies concerned difficult-to-cultivate groups of microorganisms, such as lactobacilli, clostridia, and bacteroids.
Conclusion: The real-time PCR method was able to confirm the positive results of the culture study in 94.3% of cases, whereas the growth of microorganisms in PCR-positive samples was noted only in 32% of cases. The spectrum of microbial markers determined by real-time PCR significantly exceeded that for the culture method.
Обоснование. За последние десятилетия значительное внимание учёных уделено исследованию микробиоты кишечника, однако существующие диагностические подходы к её оценке в клинической практике весьма ограничены. В связи с этим назрела необходимость внедрения валидированного лабораторного метода с учётом современных представлений о микробиоте кишечника.
Цель. Сопоставление результатов исследования микробиоты толстого кишечника у детей рутинным культуральным методом (посев фекалий на дисбиоз кишечника) и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
Материалы и методы. 102 образца фекалий детей в возрасте от 0 до 14 лет были одновременно исследованы классическим культуральным методом и методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием набора реагентов «Энтерофлор Дети» (ДНК-Технология, Россия). Методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени определяли 46 параметров: общую бактериальную массу, 40 групп представителей нормальной и условно-патогенной микробиоты, в том числе количества «детских» и «взрослых» бифидобактерий, а также 2 маркера патогенности (гены энтеротоксинов Сlostridioides difficile tcdA и tcdB, ген адгезина Streptococcus agalactiae Srr2) и маркер резистентности к антибиотикам — ген mecА. По каждому показателю определяли абсолютное количество, выраженное в геном-эквивалентах на 1 грамм фекалий (ГЭ/г), и рассчитывали долю от выявленных бактерий.
Результаты. Культуральным методом в исследованных образцах идентифицировали до 15 групп микроорганизмов. Применение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволило идентифицировать 43 группы микроорганизмов в количествах до 1011 ГЭ/г, 2 гена патогенности и один ген антибиотикорезистентности, а также рассчитать долю отдельных микроорганизмов в микробном сообществе. Наибольшее совпадение результатов отмечали для Candida albicans (все пробы отрицательные при исследовании обоими методами), Bifidobacterium spp. (92,2% совпадений), Escherichia coli (80,4% совпадений) и Staphylococcus aureus (64,7% совпадений). Для остальных сравниваемых групп микроорганизмов сопоставимые результаты регистрировали лишь в 9,8–36,3% образцов. Наиболее выраженные расхождения касались труднокультивируемых групп микроорганизмов, таких как лактобациллы, клостридии и бактероиды.
Заключение. Метод полимеразной цепной реакции в реальном времени смог подтвердить положительные результаты культурального исследования в 94,3% случаев, тогда как рост микроорганизмов в случае положительной ПЦР отмечали только в 32% случаев. Спектр определяемых данным методом микробных маркеров существенно превосходил таковой для культурального метода.