Испытания разработанного набора реагентов для выявления возбудителей кишечных инфекций методом изотермической амплификации ДНК

Обоснование. Изотермическая петлевая амплификация LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) — перспективный для диагностики инфекционных заболеваний метод, имеющий высокий потенциал перехода к формату тестов «у постели больного». Он применяется для обнаружения широкого спектра возбудителей инфекционных заболеваний, однако подобные тесты для выявления возбудителей кишечных инфекций в Российской Федерации практически отсутствуют.

Цель — испытания диагностического набора реагентов для выявления ДНК возбудителей кишечных инфекций Shigella spp., энтероинвазивных E. coli, Salmonella spp., термофильных Campylobacter и кишечных аденовирусов группы F методом LAMP.

Материалы и методы. Использовали в качестве мишеней для амплификации фрагменты генов ipaH Shigella, invA Salmonella, CJE0832 кампилобактерий C. jejuni и C. coli, гена белка гексона аденовируса F 40. Клинические образцы получали от пациентов с характерными симптомами диареи и от пациентов без симптомов, всего 254 образца. Для приготовления экстракта кала готовили 10% суспензию в фосфатно-солевом буфере, осаждали твёрдые частицы. Для выделения ДНК из экстрактов использовали наборы реагентов «АмплиТест® Рибо-Преп» (РУ № РЗН 2020-12985, 22.12.2020) и «АмплиТест® Магно-Сорб-Комбо» (РУ № РЗН 2022_19200, 21.12.2022) производства ФГБУ «ЦСП» ФМБА России. Результаты амплификации детектировали с использованием специфических флуоресцирующих зондов, амплификацию проводили в мультиплексном формате с использованием двух смесей, первая из которых позволяет выявлять ДНК Shigella и EIEC, Campylobacter и ВКО, а вторая — ДНК аденовирусов группы F и Salmonella.

Результаты. Аналитическую чувствительность оценивали на модельных образцах биоматериала, содержащих ДНК целевых мишеней с известной концентрацией. Показано, что ДНК Shigella, EIEC, Salmonella, Campylobacter и аденовирусов группы F воспроизводимо выявляется в концентрации не менее 5×10³ копий/мл (общее количество повторов n =60). Cпецифичность подтверждена на панели ДНК штаммов аденовирусов различных типов и ДНК бактериальных штаммов. При исследовании 254 клинических образцов показано совпадение результатов, полученных разработанным протоколом на основе LAMP и методом ПЦР (набор сравнения «АмплиСенс® ОКИ-скрин-FL»). Диагностическая чувствительность LAMP протокола составила не менее 92,6%, специфичность — не менее 98,2% с учётом доверительной вероятности ( p =0,95). Высокие аналитические и диагностические характеристики разработанного набора реагентов «АмплиТест® OKI LAMP» были подтверждены при проведении клинико-лабораторных испытаний, набор зарегистрирован в качестве медицинского изделия для диагностики in vitro (РУ РЗН 2024/23503 от 04.09.2024).

Заключение. Разработанный набор реагентов на основе LAMP позволяет выявлять кишечные патогены за время, не превышающее один час, и имеет аналитические и диагностические характеристики, сравнимые с ПЦР.