Клиническая лабораторная диагностика

Обоснование. За последние десятилетия значительное внимание учёных уделено исследованию микробиоты кишечника, однако существующие диагностические подходы к её оценке в клинической практике весьма ограничены. В связи с этим назрела необходимость внедрения валидированного лабораторного метода с учётом современных представлений о микробиоте кишечника.

Цель. Сопоставление результатов исследования микробиоты толстого кишечника у детей рутинным культуральным методом (посев фекалий на дисбиоз кишечника) и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Материалы и методы. 102 образца фекалий детей в возрасте от 0 до 14 лет были одновременно исследованы классическим культуральным методом и методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием набора реагентов «Энтерофлор Дети» (ДНК-Технология, Россия). Методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени определяли 46 параметров: общую бактериальную массу, 40 групп представителей нормальной и условно-патогенной микробиоты, в том числе количества «детских» и «взрослых» бифидобактерий, а также 2 маркера патогенности (гены энтеротоксинов Сlostridioides difficile tcdA и tcdB, ген адгезина Streptococcus agalactiae Srr2) и маркер резистентности к антибиотикам — ген mecА. По каждому показателю определяли абсолютное количество, выраженное в геном-эквивалентах на 1 грамм фекалий (ГЭ/г), и рассчитывали долю от выявленных бактерий.

Результаты. Культуральным методом в исследованных образцах идентифицировали до 15 групп микроорганизмов. Применение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволило идентифицировать 43 группы микроорганизмов в количествах до 10¹¹ ГЭ/г, 2 гена патогенности и один ген антибиотикорезистентности, а также рассчитать долю отдельных микроорганизмов в микробном сообществе. Наибольшее совпадение результатов отмечали для Candida albicans (все пробы отрицательные при исследовании обоими методами), Bifidobacterium spp. (92,2% совпадений), Escherichia coli (80,4% совпадений) и Staphylococcus aureus (64,7% совпадений). Для остальных сравниваемых групп микроорганизмов сопоставимые результаты регистрировали лишь в 9,8–36,3% образцов. Наиболее выраженные расхождения касались труднокультивируемых групп микроорганизмов, таких как лактобациллы, клостридии и бактероиды.

Заключение. Метод полимеразной цепной реакции в реальном времени смог подтвердить положительные результаты культурального исследования в 94,3% случаев, тогда как рост микроорганизмов в случае положительной ПЦР отмечали только в 32% случаев. Спектр определяемых данным методом микробных маркеров существенно превосходил таковой для культурального метода.

Введение. После лечения туберкулеза у детей, в ряде случаев, формируются остаточные изменения в лёгких, определяющие риски развития осложнений или рецидивов заболевания. С этим связана целесообразность применения патогенетически обоснованных и неинвазивных лабораторно-диагностических критериев для оценки и стратификации данных рисков.

Цель – у детей с посттуберкулезными изменениями в легких оценить ex vivo способность изолированной из цельной крови фракции нейтрофильных лейкоцитов к формированию внеклеточных ловушек (НВЛ) при неспецифической антигенной стимуляции во взаимосвязи с in vivo уровнем цитруллинированного гистона H3 (citH3) крови.

Методы. Были исследованы группы: контроля («Контроль») – здоровые дети возрастом от 4 до 7 лет, n=26 и дети с остаточными посттуберкулезными изменениями («Пост-ТБ»), от 4 до 14 лет, n=18. Критерии исключения: наличие сопутствующих хронических соматических, инфекционных и аутоиммунных заболеваний. На изолированную из крови фракцию нейтрофилов воздействовали полибактериальным стимулятором. Появление НВЛ оценивали с помощью люминесцентной микроскопии. Уровень citH3 определяли методом иммуноферментного анализа. Распределение значений показателей носило отличный от нормального характер (критерий Шапиро-Уилка). Различия между группами считали значимыми при p<0,05 и оценивали с использованием критериев Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса и post-hoc анализа. По показателю «Суммарная доля НВЛ» группа Пост-ТБ была разделена на подгруппы с низкой и высокой способностью к формированию НВЛ («Пост-ТБ-Н» и «Пост-ТБ-В», соответственно).

Результаты. В группе Пост-ТБ доля нитевидных НВЛ и суммарная доля НВЛ были выше, чем в группе Контроль (p=0,0016 и p=0,0035, соответственно). Концентрация цитруллинированного гистона H3 в крови в группе Пост-ТБ превышала значения в группе Контроль (p=0,0101). При этом различий по содержанию облаковидных НВЛ между группами выявлено не было (p=0,8047). В подгруппе Пост-ТБ-В процент нитевидных НВЛ и суммарная доля НВЛ превышали значения в группе Контроль, (p_post-hoc = 0,00002 и p_post-hoc < 0,0001, соответственно). В подгруппе Пост-ТБ-Н доля нитевидных НВЛ была ниже значений подгруппы Пост-ТБ-В (p_post-hoc = 0,0021). Подгруппы Пост-ТБ-Н и Пост-ТБ-В характеризовались различной концентрацией цитруллинированного гистона H3 в сыворотке крови, уровень которого в подгруппе Пост-ТБ-В превышал значения группы Контроль (p_post-hoc = 0,0105) и Пост-ТБ-Н (p_post-hoc = 0,0292). Коэффициент ранговой корреляции Спирмена между долей нитевидных НВЛ и концентрацией citH3 в крови составил r=0,711 (p=0,0006).

Заключение. Способность нейтрофилов к формированию НВЛ у детей с посттуберкулезными изменениями в легких имеет особенности, а ее исследование может стать полезным для персонифицированной оценки риска возникновения рецидива заболевания.

Клиническое значение антигенов групп крови определяется их способностью стимулировать образование аллоантител в ответ на трансфузии эритроцитов. Частота выявления антител у реципиентов имеет особенности, характерные для разных стран, и зависит от антигенного разнообразия популяции, применения антирезусного иммуноглобулина и мероприятий по профилактике аллоиммунизации при трансфузионной терапии. Эффект действия антител при трансфузиях несовместимых эритроцитов варьирует в широких пределах — от лёгкой симптоматической анемии до угрожающих жизни осложнений.

Проведённый анализ масштабных иммуногематологических исследований дал возможность разделить антигены на высокоиммуногенные — D, E, K (Kell); средней иммуногенности — C, c, Jk^a (Kidd), Fy^a (Duffy), M (MNS), Le^a (Lewis); низкой иммуногенности — другие антигены эритроцитов. Обзор ежегодных отчётов SHOT (Serious Hazards of Transfusion, Великобритания) и FDA (Food and Drug Administration, США) показал, что моноспецифические антитела к антигенам Jk^a, Jk^b, Fy^a, c, E являются причиной наибольшего числа отсроченных гемолитических реакций, а антитела к антигенам K, Fy^a, c, Jk^a, Jk^b — наибольшего числа смертельных случаев, связанных с переливанием крови.

Обзор исследований, посвящённых иммунологической безопасности трансфузий эритроцитов, позволил разработать метод количественной оценки иммуногенности антигенов и клинической значимости моноспецифических антител. Каждому антигену эритроцитов присвоено числовое значение, выраженное в условных единицах. Это фактор значимости антигена, который может быть использован при фенотипическом подборе доноров, в том числе с помощью компьютерной программы, а также при выборе наименее клинически опасных с точки зрения развития аллоиммунизации и посттрансфузионных осложнений эритроцитов в критических ситуациях, когда отсутствуют компоненты крови, полностью совместимые с реципиентом по фенотипу.